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[指南]植物总RNA的提取方法 实验二、植物总RNA的提取 一、实验目的: 1.了解真核生物基因组RNA提取的一般原理。 2.掌握Trizol提取RNA的方法和步骤。 3.了解RNA纯度的检测。 二、一般原理 Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA Trizol试剂配制 苯酚饱和液(38%)-380ml/l 硫氰酸胍盐(0.8M-118.16g) 硫氰酸铵(0.4M)-- 76.12g 醋酸钠pH 5(0.1M)- 33.4ml 甘油 – 50ml 加水至1L 三、材料 植物组织 四、设备 移液器，冷冻高速离心机，低温冰箱，台式高速离心机，液氮罐，陶瓷研钵，1.5ml离心管。 五、试剂 1、无RNA酶的无菌水:用将高温烘烤的玻璃瓶(180? 2小时)装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC(体积/体积)，处理过夜后高压灭菌。 2、75%乙醇:用DEPC处理水配制75%乙醇，(用高温灭菌器皿配制)，然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 3、氯仿:异戊醇 [24 : 1 (v/v)] 、氯仿。 4、异丙醇、无水乙醇、70,乙醇。 5、Trizol试剂。 六、操作步骤 1、取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5ml tube分装0.1克样品; ,. 每管加入0.5ml Trizol液，迅速混匀，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 ,、室温下静置5,,,分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离 ,、加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒，室温静置,分钟 ,、 10000r/min离心10分钟 ,、取上清液(水相)转入一新的离心管，加入等体积异丙醇，室温放置10分钟，10000r/min离心10分钟。 ,、弃去上清液，加入至少1ml的70%乙醇，涡旋混匀，4?下,,,,r/min离心5分钟。 ,、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中，必要时可55?-60?水溶 10分钟。 RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70? 七、检测 1、DNA的紫外分光光度计检测 OD260/OD280>1.8 1OD260=40 μg/mL DNA 2、甲醛变性琼脂糖电泳检测 八、注意事项 (1)Trizol、DEPC等有毒，与皮肤接触会引起伤害。操作过程带手套，在通风条件下操作。 (2)避免带入RNase进入样品 带手套，别用手碰任何与样品接触的物品。 使用新的已灭活RNase的塑料器皿与用具。 (3)爱护仪器设备,安全操作 作业: 1、RNA酶的变性或失活剂有那些,其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种, 2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。 补充: ,,,检测方法 ,. 此外分光光度计检测 ,,,,,值,,时，相当于含,,μg/mL DNA ,,,,,,,,,,,,,.,,,.,时，DNA较纯 小于,.,时，蛋白含量较高，大于,.,则含有,,,或有断裂,,, 植物总RNA的提取规程 2007-07-31 00:00:00 来源: 评论:0 我要评论 一、实验目的掌握植物总RNA提取的原理和方法二、实验原理 RNA的提取:破坏细胞膜—除去蛋白—除去DNA—除去盐离子。RNase是一类生物活性极其稳定的酶类，能耐高温、耐酸、耐碱，高压灭菌处理也不能使其完全失活。在提取RNA实验中，要尽量抑制RNase的活性。 DEPC(焦磷酸二乙酯)是很强的… , , 一、实验目的 掌握植物总RNA提取的原理和方法 二、实验原理 RNA的提取:破坏细胞膜—除去蛋白—除去DNA—除去盐离子。 RNase是一类生物活性极其稳定的酶类，能耐高温、耐酸、耐碱，高压灭菌处理也不能使其完全失活。在提取RNA实验中，要尽量抑制RNase的活性。 •DEPC(焦磷酸二乙酯)是很强的RNase抑制剂，可以使RNase的活性丧失。实验中使用的 枪头、 EP管、溶液都要利用0.1%的DEPC处理，Tris不可以用DEPC处理。耐高温的玻璃器皿等要在250?烘烤4小时以上。 •内源的RNase一般利用蛋白质变性剂除去。如苯酚、氯仿、胍、SDS、十二烷基肌氨酸钠等。 无水乙醇、高浓度的盐溶液和异丙醇中可以沉淀RNA或DNA，前两者利于沉淀大片段的核酸。 注意:DEPC是一种具有致癌嫌疑的有机物～相关操作要在通风橱中完成。 另外DEPC对单链的 DNA或RNA具有破坏作用，利用DEPC处理过的溶液和物品都要经过高温灭活处理后才可以使用(DEPC会分解成水和CO) 。所有沾染DEPC的液体或物品在使用、遗弃前要高温灭活处理。 2 RNA操作的整个相关实验过程应该在超净台上完成, 操作者应配带口罩、帽子和手套。 三、实验材料、器具及药品 小麦叶片。 高速离心机、研钵、药匙、滤纸、冰盒、口罩、 手套、EP管架、超净工作台、移液器、枪头等。 预冷的乙醇和70%乙醇、液氮、RNA提取试剂盒等。 四、实验步骤 1.打开超净工作台和紫外灯，用乙醇烧研钵、药匙。 2.样品的裂解:液氮中将组织捣成粉末，液氮挥发后加 1 ml A液，立即用移液器抽打均匀。-20?冰上静置10min， 加200µl B液，用力颠倒混匀(20余次)，冰上静置10min，室温离心12000rpm，10min。 3.小心将上层水相移到另一个离心管中，加等体积 B液，颠倒混匀(20余次)，冰上静置10min，室温离心12000rpm，10min。 4.再小心将上层水相移到另一个离心管中，加等体积 C 液，颠倒混匀，冰上静置30min，室温离心12000rpm，10min。 5.弃去上层水相，加400µl E液和40µl D液，混匀后55?水浴5-10min，中间摇动一次。 6. 将上清移到另一个离心管中，加1ml预冷的乙醇，颠倒混匀，冰上静置30min，室温离心12000rpm，10min。 7.弃去上层水相，加1ml预冷的70%乙醇,转动清洗后倒掉乙醇，在超净工作台上吹干。 8.加20µl E液溶解RNA，4?保存备用。 TRIZOL法提取植物总RNA 所用器皿均按RNA提取的常规方法处理。具体程序为: (1):取材料，加液氮研磨，在1.5 ml离心管中，分别加1ml TRIZol(Tiangen)[或RNAiso(TAKALA)]试剂，在离心管中加5-6勺样品，约1g，用力摇15秒(也可涡旋)，室温静置15分钟; in; (3)4 ?，12,000g离心15分钟; (2)加200ul的氯仿上下颠倒混匀，室温静置2m (4)将上清液移入新的1.5ml离心管，分层，下层红色酚层，界面，上层水相(含RNA); (5)加入等体积的异丙醇沉淀RNA(一般500-700ul)，轻微颠倒，-20?沉降1h(此过程可延长) (6)4 ?，12,000g离心15分钟; (7)弃上清，加1ml 75%乙醇，轻微颠倒，清洗沉淀，在7,000g，4?，离心5分钟; (8)弃上清，风干(不能太干否则RNA很难溶解)，加适当体积 RNase-free water 溶解。 1.2.2 总RNA定量与完整性检测 (1)定量:测A260nm、A280nm处的吸光值，计算A260/A280的值，以估计总RNA纯度。通过A260的值计算总RNA量。 (2)RNA完整性检测:在1.2%普通琼脂糖胶上分离总RNA，若有三条 (代表rRNAs) 条带清晰，无拖尾的带(如图)，则说明总RNA完整，可用于后续实验。 28 S: 4800 nt; MW:1.6×10的6次方 18 S : 1900 nt ; MW:6.1×10的5次方 5S : 120 nt; MW:3.6×10的4次方 本文来源：https://www.dywdw.cn/66495797fe0a79563c1ec5da50e2524de518d0e6.html
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2022-08-08
