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建立HPLC用于双黄连口服液中黄芩苷的含量测定以及方法学验证 1040314 潘明 对原实验选用方法进行改进的原理： 黄芩苷有两个最大吸收波长，分别为278nm和315nm，因为双黄连口服液中另一主要成分绿原酸的最大吸收波长为326nm，为保证得到良好峰形，仍采用278nm为检测波长。黄芩苷为黄酮类化合物，有多酚羟基结构，在低温和酸性条件下稳定，一般将pH控制在3-4之间。原实验用冰醋酸调节pH，但醋酸有易挥发不稳定的缺点，所以改用0.4%的磷酸溶液（低浓度减少磷酸盐对色谱柱的侵蚀），流动相为甲醇-0.4%磷酸(50∶50 ）。 改进后实验条件: 色谱柱：C18(250mmX4．6mm，5μm )； 流动相：甲醇-0.4%磷酸(50∶50 ） 流速：1.0ml/min 进样量：20µl 柱温：室温 理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于1500 样品含量的测定方法： 取样品溶液，按上述色谱条件，进样测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。 方法学验证： 1.专属性实验 空白溶液：甲醇-0.4%磷酸(50∶50 ） 黄芩苷对照品溶液制备：精密量取黄芩苷对照品适量，精密称定，制 成0.1mg/ml溶液 供试品溶液：精密量取双黄连口服液1ml，置50ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声波处理20min，放置至室温，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得 不含黄芩苷的阴性对照供试品溶液制备：原则上需要，制备复杂，本实验不做 取上述溶液分别进样，测定，观察在相同位置上是否有与标准品溶液对应的峰，表明空白对照无干扰 2 回收率实验 取制得的供试品溶1ml置于10ml容量瓶中，共6份 。精密量取黄芩苷对照品0.013g，0.016g和0.019g各两份，分别加入上述6份溶液中，依法测得其含量，并计算回收率。（加入的标准品一般为供试品含量的80% 100% 120%） 加样回收率=（测得量-本底量）/加入量 ×100% 3.线性范围考察 精密量取上述黄芩苷对照品溶液1，2，3，4，5，6m1分别置于lOml量瓶中，加5O% 甲醇稀释至刻度，按上述色谱条件，分别取20µl进样，记录色谱图。以峰面积y对对照品进样量(mg/ml)线性回归，得黄芩苷标准曲线。 4 精密度实验 （1）进样精密度：取供试品溶液20µl，重复进样6次，计算RSD （2）重复性：精密量取同一批号样品6份，按样品溶液的制备方法，分别配置供试品溶液，测定黄芩苷的含量，计算RSD。 （3）中间精密度：取同一批样品，甲乙两个操作员在两台不同的一起上分别独立操作，计算RSD（一般仅在报批时测定，本实验不做） 5.检测限与定量限 信噪比3：1测检测限，信噪比10:1测定量限 6.供试品稳定性实验 取重复性实验中的第一份溶液，室温下在0，3，6，9，12 小时测定，结果表明，本品的供试品溶液在室温12小时内基本稳定 7.重现性实验 在不同的实验室，不同的工作人员，不同的仪器，不同的化学试剂来源的条件在测定（一般仅在报批时测定，本实验不做） 8.耐用性实验 改变流动相的组成，流速和pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温。考察条件改变对分析结果的影响及影响大小（本实验不做） 本文来源：https://www.dywdw.cn/8cafac7bcfc789eb162dc805.html
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2022-03-29
