【#第一文档网# 导语】以下是®第一文档网的小编为您整理的《拟南芥蘸花法》,欢迎阅读!
农杆菌蘸花转化拟南芥法 1、 将低温保存的带有表达载体的农杆菌菌株,分别在对应抗性平板上划线,挑取单菌落接种于5ml的已加入对应抗生素的液体LB培养基中,28℃下250rpm振荡培养18-24h; 2、 然后相同条件下按照1:100接种扩大培养,总菌液体积为200ml,直到OD600值在0.8-1.0范围内; 3、 离心沉淀并去上清液,用等体积的5%的蔗糖溶液重悬菌体,在菌液中加入0.02%-0.04%的SilwetL-77混匀; 4、 将拟南芥的花序在菌液中蘸取0.5-1min即可(在转化前要先将拟南芥的角果剪掉); 5、 然后将拟南芥苗放置于黑暗,湿润的条件下16h,一周后,重复侵染一次; 6、 收种后种植后代,向12d的幼苗上喷洒54mg/ml除草剂或在将种子播种于抗性MS平板上以筛选阳性植株。 拟南芥播种 1、 将拟南芥种子用50%的84消毒液表面消毒6-8 min,继而用无菌水漂洗3次; 2、 在0.1%琼脂糖中悬浮,然后播种在抗性的MS培养基上,4ºC低温避光处理2天后,转入光照培养室生长。 3、 幼苗7d左右便可筛到阳性植株,并移栽到含有蛭石的营养土中继续生长(蛭石:营养土=1:3)。植株种植的培养箱维持22℃恒温和16h光照/8h黑暗培养的循环培养条件。 注:几种常用抗生素的工作液浓度 Kanamycin 50μg/ml Gentamicin 50μg/ml Rifampicin 25-50μg/ml Hygromycin 50μg/ml Barstar 25-50μg/ml 注:MS培养基配方(1L) MS盐 4.4g MES 0.5g 蔗糖 10g 调PH至5.8-6.0 加Agar 10g (在抗性MS培养基上筛选阳性转基因植株时可不加蔗糖防止长菌) 42. Schägger H, von Jagow G (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.Anal Biochem166:368–379. 本文来源:https://www.dywdw.cn/d6db71e20029bd64783e2c4c.html