叶绿体色素的定量测定

2022-08-17 08:04:15 第一文档网 [ 字体：小中大 ] [

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叶绿素含量的测定

叶绿素的含量与植物光合作用及氮素营养有密切的关系，在科学施肥、育种及植物病理研究上常有测定的需要。

方法 Ⅰ

一、目的

掌握叶绿素含量测定的基本原理和方法。

二、原理

叶绿素与其他显色物质一样，在溶液中如液层厚度不变则其吸光度与它的浓度成一定的比例关系。已知叶绿素a 、b在652 nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5）。因此，在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，即可计算出叶绿素a 、b的总量。

三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：菠菜叶；芥菜叶或其他植物叶片。

2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；漏斗；25ml容量瓶；剪刀；滤纸；玻棒等。

3. 试剂：95﹪乙醇、石英砂、碳酸钙粉。

四、实验步骤

1. 叶绿素的提取

称取植物鲜叶0.20g（可视叶片叶绿素含量增减用量），剪碎放入研钵中，加少量碳酸钙粉和石英砂及3～5ml95﹪乙醇研成匀浆，再加约10ml 95﹪乙醇稀释研磨后，用滤纸过滤入25ml容量瓶中，然后用95﹪乙醇滴洗研磨及滤纸至无绿色为止，最后定容至刻度，摇匀，即得叶绿素提取液。 2. 测定

取光径为1cm的比色杯，倒入叶绿素提取液距杯口1cm处，以95﹪乙醇为空白对照，在652 nm波长下读取吸光度（A）值。

五、计算

将测得的吸光度A652 值代入公式(1), 即可求得提取液中叶绿素浓度。所得结

－1

果再代入公式(2)，即可得出样品中叶绿素含量（mg ·gFw）。 A652

C ( mg ·ml ) = ————

……………………………………………………（1）

34.5

公式中： C — 叶绿素（a 和b ）的总浓度( mg ·ml )

A652 — 表示在652nm 波长下测得叶绿素提取液的吸光度

－1

－1

34.5为叶绿素a和b混合溶液在652nm波长的比吸收系数（比色杯光

径为1cm, 样品浓度为1g·L－1时的吸光度）。

C（mg·ml）× 提取液总量（ml）

－1

叶绿素含量（mg ·gFw）= ———————————————— ……（2）

样品鲜重（g）

－1

方法 Ⅱ

一、目的

掌握叶绿素a、b含量测定的基本原理和方法。

二、原理

叶绿素a、b分别在663nm和645nm波长处有最大的吸收峰，同时在该波长处叶绿素a.、

b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert－Beer定律，列出浓度C与吸光度A之间的关系式：

A663 = 82.04 Ca + 9.27Cb …………………… ( 1 ) A645 = 16.75 Ca + 45.6Cb …………………… ( 2 )

（1）、（2）式中的A663. A645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时测得的吸光度。

Ca、、Cb为叶绿素a 、b的浓度，单位为mg·L－1。

82.04 、9.27为叶绿素a 、b在波长663nm下的比吸收系数。 16.75 、45.6为叶绿素a 、b在波长 645nm下的比吸收系数。解（1）、(2 )式联立方程，得：

Ca=12.70 A663 – 2.69 A645 …………………… ( 3 ) Cb=22.9 A645 – 4.68 A663 …………………… ( 4 ) CT =Ca + Cb= 20.21 A645 + 8.02A663 ……………………( 5 ) Ca、Cb为叶绿素a 、b的浓度, CT为总叶绿素浓度，单位：（mg · L－1），.利用上面( 3 )、（4）、（5）式可以分别计算出叶绿素a 、b及总叶绿素浓度。

三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：菠菜叶、芥菜叶或其他植物叶片

2. 仪器设备：电子分析天平；分光光度计；恒温水浴锅；25ml刻度试管；剪刀；试管；试管架；玻棒等。 3. 试剂：80﹪乙醇。

四、实验步骤

1. 叶绿素的提取

从植株上选取有代表性的叶片数张（除去粗大叶脉）剪碎后混匀，快速称取0.2g (可视样品叶绿素含量高低而增减用量)，置于25ml刻度试管中，加80﹪

乙醇 10ml左右，加塞放入60～80℃水浴中保温提取叶绿素（或常温下放在暗处浸提12～24h），至叶片全部褪绿为止，冷却后，用80﹪乙醇定容至刻度，此液即为叶绿素提取液。 2. 测定

取光径为1cm的比色杯，加入叶绿素提取液距比色杯口1cm处，以80﹪乙醇作为对照，分别于663nm及645nm波长下测定吸光度（A）值。

五、结果计算

将测定得到的吸光度 A663、A645值分别代入上面( 3 )、( 4 )、（5 ）式计算出Ca 、Cb及

CT (即叶绿素a 、b 及叶绿素总量浓度)。再按下式计算出叶绿素a 、b及叶绿素总含量。

Ca × 提取液总量 (ml)

叶绿素a 含量（mg ·g－1Fw）= —————————————

样品鲜重（g）× 1000

Cb × 提取液总量 (ml)

叶绿素b 含量（mg ·g－1Fw）= ————————————－

样品鲜重（g）× 1000

CT × 提取液总量(ml)

－1

叶绿素总含量（mg ·g Fw）= ————————————－

样品鲜重（g）× 1000

最后计算出叶绿素a / 叶绿素b的比值，并加以分析。

叶绿体色素的定量测定

【原理】

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。

根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的消光度D与其中溶质浓度C和溶液层厚度L成正比，即： D＝kCL(7－1)

式中：k为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1CM时，k为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而求得。

如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下消光度的总和，这就是消光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素A、B和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在3个特定波长下的消光度D，并根据叶绿素A、B及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素A、B时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

已知叶绿素A、B的80％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nM和645nM，又知在波长663nM下，叶绿素A、B在该溶液中的比吸收系数分别为8204和927，在波长645nM下分别为1675和4560，可根据加和性原则列出以下关系式：

D663＝8204CA＋927CB(7－2) D645＝1675CA＋4560CB (7－3)

式中D663、 D645——叶绿素溶液在波长663nM和645nM时的消光度； CA、 CB——叶绿素A和B的浓度(Mg／L)。解方程组7－2、7－3，得： CA＝1272D663－259D645(7－4) CB＝2288D645－467D663 (7－5) 将CA与CB相加即得叶绿素总量CT

CT＝CA＋CB＝2029D645＋805D663(7－6)

另外，由于叶绿素A、B在652nM的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数(均为345)，也可以在此波长下测定一次消光度(D652)而求出叶绿素A、B总量：

CT＝(D532×1000)／345(7－7)

在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。

LICHTenTHAler等对Arnon法进行了修正，提出了80％丙酮提取液中3种色素含量的计算公式： CA＝1221D663281D646(7－8) CB＝2013D646503D663（7－9)

CX·C＝(1000D470327CA104CB)／229(7－10) 式中CA、CB:叶绿素A、B的浓度； CX·C:类胡萝卜素的总浓度；

D663、D646和D470：叶绿体色素提取液在波长663nM、646nM和470nM下的消光度。

由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素A、B在96％乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nM和649nM，类胡萝卜素为470nM，可据此列出以下关系式：

CA＝1395D665－688D649 (7－11) CB＝2496D649－732D665 (7－12)

CX·C＝(1000D470－205CA－1148CB)／245(7－13) 【仪器与用具】

分光光度计；研钵1套；剪刀1把；玻棒；25Ml棕色容量瓶3个；小漏斗3个；直径7CM定量滤纸；吸水纸；擦镜纸；滴管；电子天平(001g感量)。

【试剂】

96％乙醇(或80％丙酮)；石英砂；碳酸钙粉；【方法】

1取新鲜植物叶片(或其他绿色组织)或干材料，擦净组织表面污物，剪碎(去掉中脉)，混匀。

2称取剪碎的新鲜样品02g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3Ml 96％乙醇(或80％丙酮)研成匀浆，再加乙醇10Ml，继续研磨至组织变白，静置3～5Min。

3取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25Ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

4用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25Ml，摇匀。

5把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以96％乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nM下测定消光度。

6按公式7－11、7－12、7－13(如用80％丙酮，则按公式7－8、7－9、7－10)分别计算叶绿素A、B的类胡萝卜素的浓度(Mg／L)，7－11、7－12式相加即得叶绿素总浓度。

7求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量(用每克鲜重或干重所含毫克数表示)：叶绿体色素含量＝色素的浓度（C)×提取液体积×稀释倍数样品鲜重（或干重）测定结果记入表7－1。【注意事项】

1为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。

2叶绿体色素提取液不能浑浊。可在710nm或750nM波长下测量消光度，其值应小于当波长为叶绿素A吸收峰时消光度值的5％，否则应重新过滤。

3用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长精确度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差1nM，则叶绿素A的测定误差为2％，叶绿素B为19％，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素A和B来校正。

4在使用低档型号分光光度计(如：72、125、721型等)测定叶绿素A、B含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差，单色光的纯度低(±5～7nM)，与高中档仪器如岛津UV－120、UV－240等测定结果相比，叶绿素A的测定值偏低，叶绿素B值偏高，A／B比值严重偏小。因此，使用时必须用高档分光光度计对低档的分光光度计进行校正。

表7-1叶绿体色素含量记载表测定日期：

处理重复光密度色素浓度（mg/L）组织中各色素含量（mg/g)D665D649D470aba+bx·caba+bx·ca/b123x123x

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