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为什么引物在某些时候需要纯化 DNA合成结束后，完整的DNA链在碱性溶液（如氢氧化铵）的作用下从固相支持物中解理下来。解离下来的溶液中既包含了完整的所需寡核苷酸，同时也包含了在合成过程中失败的DNA链（错误序列）。比如合成一个20个碱基寡核苷酸，其洗脱溶液中也包含了19，18，17个碱基等合成时错误的序列。错误序列的数量取决于合成效率。在许多实验如PCR中，这些错误的序列会与正确的全长产物竞争，因此在使用之前需要将其去除以提高下游应用的成功率。 纯化方式 特点 将寡核苷酸通过常规的层优点 即用型的不含盐分的DNA样品，适用于无需进行引物纯化的后续应用，如PCR和测序等 适用于需要引物准确性的多种下游应用 脱盐 析柱，去除其中的盐分，但不能去除错误序列 Cartridge 采用反向层析进行纯化，可去除错误的序列 通过高效液相层析HPLC （HPLC）去除错误序列或未标记物 通过分子大小和构象的不适用于某些需要确保高纯度的引物的应用 PAGE 同将正确的全长序列和错误序列进行分离 纯度最高（≥95%），适用于构建突变体或克隆接头等对纯度要求较高的应用 不同应用对纯化方式的选择 应用领域 AFLPTM 分析 建议的纯化方式 脱盐引物在限制性片段扩增多态性研究（ARFP）中可被成功应用 反义研究 循环测序 文库构建中的第一链cDNA合成 荧光测序 凝胶迁移实验 HPLC纯化的引物在相关文献中引用最多 脱盐纯化的引物已经足够 用于文库构建中第一链合成的cDNA通常在其5’端有限制性内切酶克隆位点，因此最好用全长的，通过Cartridge、HPLC或PAGE纯化的引物 四种纯化级别的引物都可成功应用 建议使用Cartridge、HPLC和PAGE纯化的引物进行凝胶迁移率实验 建议使用PAGE纯化引物。如果购买了脱盐引物，可以GeneTrapper筛选 使用PAGE纯化说明书对其进行进一步纯化。在GeneTrapper系统中的加尾反应时，引物需要事先经过酚抽提和乙醇沉淀。 恒温测序 微阵列 PCR 脱盐引物已经足够，Cartridge、HPLC和PAGE纯化引物也可以。 标准脱盐引物已经足够 对于标准PCR，脱盐引物即可正常使用，其它三种纯度更高的方式也可以 为达到最高效率，Cartridge、，HPLC和PAGE纯化的引物是最好的选择。因为引物合成是从3’端到5’端，不完整的寡核苷酸的会从5’端缺失。在这些应用中使用5’端序列完整的全长序列是很重要的，否则缺失5’端部分序列的一组PCR产物将被合成 全长引物最适合有效的克隆，利用Cartridge、HPLC或5’端序列较为重要的PCR（例如限制性酶切位点，RNA聚合酶启动子） 克隆接头产物 PAGE纯化方式可得到合适的引物。对大于60个碱基的引物，PAGE纯化方式是最好的 一定要使用通过Cartridge、HPLC和PAGE纯化得到的位点特异性突变 全长引物，才可能得到最高比例的突变体克隆（尤其是预突变位点在5’端附近时）。采用脱盐引物也可以得到想要的突变。然而，一些野生型亲本载体有可能会覆盖掉这些突变。 本文来源：https://www.dywdw.cn/edcbee60cb50ad02de80d4d8d15abe23482f03c4.html
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2022-05-24
