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间充质干细胞贴壁培养实验报告 姓名：常琳 学号： 日期：2015/10/21 一、 实验原理 间充质干细胞最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前, 我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。 骨髓中除有造血干细胞外，还存在着另一种间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）MSC形成于发育中的骨髓腔，个体出生之后，附于骨髓窦的内腔面，形成一种包埋于窦状网络中的三维细胞结构，这种细胞除具有分化功能之外，可像未分化细胞那样易体外扩增。MSC又是一种免疫缺陷的细胞，可抑制T淋巴细胞反应，有异体移植的可能。正是骨髓间充质干细胞有以上所述的不同于骨髓造血干细胞的特点，使得其分离取材方便、扩增迅速、可异体移植等，为组织细胞修复提供细胞来源。 间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，心血管疾病，肝硬化，神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了更多病患的生命。此外，间充质干细胞在神经系统修复及更多方面具有长远的发展前景。 二、 实验材料 实验动物：SD大鼠，四周龄，雄性，体重80~100克 实验手术器械：解剖剪、解剖镊、止血钳、胶头滴管等 实验材料：清洗液（PBS和不含Ca+和Mg2+的HBSS）培养液DEME添加10%FBS 105IU/l青霉素和100mg/l链霉素；以及含有8%的（500IU/L）肝素钠的PBS 实验仪器：超净工作台、离心机 三、 实验操作步骤 1. 将SD大鼠处死后，浸泡于酒精中待用。 2. 将后肢用碘酒和75%的酒精消毒后，减去后肢皮毛，用解剖剪剪下两侧的股骨和胫骨 3. 将两侧的股骨和胫骨浸泡于HBSS中，并在超净工作台上清除干净其上的肌肉和韧带。并于HBSS清洗三次。 4. 切除骨两端的干骺端，暴露骨髓腔，将含有8%的（500IU/L）肝素钠的PBS用10ml注射器注射于骨髓腔内，冲洗骨髓腔。 5. 收集上述冲洗液，配平后离心（1000rpm ,8min） 6. 用添加了15%的FBS、584g/ml的L-谷氨酰胺、105IU/L青霉素和100mg/l链霉素的DEME培养液重悬细胞，以5×105个/ml的密度均匀接种到25ml的玻璃培养瓶中。 7. 将上述培养瓶做好标记后，放于37℃和5%的CO2的培养箱中培养 四、 实验注意事项 1. 两侧的股骨和胫骨尽量清除干净其上的肌肉和韧带，避免混入成纤维细胞。 2. 肌肉和韧带的分离要在HBSS液面下进行，防止污染。 3. 吹打细胞时力度适中，避免细胞的破坏。与巨噬细胞相比，其粘附性差，吹打次数较少。 4. 接种时先在培养瓶的底部接种，尽量使细胞均匀分布。 本文来源：https://www.dywdw.cn/53f772a901d276a20029bd64783e0912a2167cbd.html
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2022-04-08
