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实验五 重组质粒的PCR鉴定 一、实验目的 学习PCR实验技术的原理及操作方法 二、实验原理 聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction简称PCR)，又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶(如Tsg酶)的酶促合成反应，可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力。该技术具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分三步①变性（denaturation）；②退火(annealling)；③延伸(extension)。 三、实验内容 PCR实验 四、主要设备 PCR仪，超净工作台，电泳仪，台式高速离心机，微量加样器，紫外分析仪 五、主要试剂 Taq酶、10Xbuffer、MgCl2、dNTP、模板（质粒T＋P,稀释50×）等 六、实验方法 1、 取一个0.2ml eppendorf管，在其中按照编号顺序添加以下各种成分反应液：混匀反应混合物，短暂离心。 注意：加样过程应完全在冰上进行 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 总体积 反应物 ddH2O 10×PCR缓冲液 dNTP（10mM） 上游引物（50pM） 下游引物（50pM） MgCl2（25mM） 模板DNA（50-100ng） Taq DNA聚合酶（5U/ul） 体积/μl 13.3 2.0 0.5 0.5 0.5 2.0 1.0 0.2 20 2、将加好样的PCR管放到PCR仪中，选择预设程序进行PCR反应。 4、反应程序如下： stage1 step1 94℃预变性5min； stage2 step1 94℃变性0.5min； step2 55℃退火0.5min； step3 72℃延伸1min； stage2共循环35次。 Stage3 step1 72℃延伸7min； Stage4 step1 4℃保存。 5、 对PCR产物片段进行电泳（取5ul反应液），以Marker C为对照判断片段大小。 七、 注意事项 PCR反应的灵敏度很高，为了防止污染，使用的0.2ml eppendorf管和tip都必须是新的、无污染的。 本文来源：https://www.dywdw.cn/a3f90721bd64783e09122b66.html
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2023-01-08
