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植物组织培养研究进展 摘要 植物组织培养技术作为一种科研手段,发展异常迅猛。从组织培养的原理、培养过程中遇到的问题以及前景和展望这3方面综述了我国近几年植物组织培养的新研究。 关键词: 组织培养；存在问题；措施；发展 20 世纪后半叶，植物组织培养发展十分迅速，利用组织培养，不仅可以生产大量的优良无性系，并可获得人类需要的多种代谢物质；细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲和性障碍，在植物新品种的培育和种性的改良中有着巨大的潜力；还可获得单倍体、三倍体及其它多倍体、非整倍体；组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上分析研究的理想材料[1]。因此，植物组织培养广泛应用于植物科学的各个分支，如植物学、植物生理学、遗传学、育种学、栽培学、胚胎学、解剖学、病理学等，并广泛应用在农业、林业、医药业等多种行业，产生了巨大的经济效益和社会效益，被认为是一项很有潜力的高新技术。 1 组织培养的基本原理 1.1 植物组织培养的概念 植物组织培养技术是指在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织或潜伏芽等，或长成完整的植株的技术[2]。 1.2 植物组织培养的依据 植物组织培养的依据是植物细胞“全能性”及植物的“再生作用”。1902年，德国著名植物学家GHaberlanclt根据细胞学理论[3]，大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直到单个细胞，即植物体细胞在适当的条件下具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜力的观点。1943年，美国人White在烟草愈伤组织培养中, 偶然发现形成一个芽, 证实了GHaberlanclt的论点[4]。在许多科学家的努力下，植物组织培养技术得到了迅速发展，其理论和方法趋于完善和成熟，并广泛应用产生了巨大的经济效益和社会效益。 1.3 培养基的选择 组织培养的基础培养基有MT、MS、SH、White等[5]。由于不同植物所需要的生长条件有所不同，会对培养基做一些不同的处理，一般采用较多的是MS。组织培养采用固体培养基的较多，但只有在植物周围的营养物和激素被吸收，如果其他残留的培养基也能被利用，对工厂化生产的成本减少方面有很大的帮助。董雁等[6]利用回收转换后废弃的继代培养基，加入原继代培养基30 %浓度母液的培养基，培养效果与原继代培养基的基本相同，说明继代培养基再利用是可行的，这为规模化组培育苗开辟了新的途径。杜勤[7]等在无外源激素条件下，研究液体和固体培养基对黄瓜子叶培养器官分化的影响，结果用液体培养基直接诱导花芽率更高，分化高峰期出现的时间也更早，说明液体培养基对外植体的生长更有利，只是固体培养基更易操作而被较广泛应用。 2 植物组织培养过程中存在的问题 2.1 污染问题 组织培养过程中的污染包括内因污染和外因污染。内因污染指由于外植体的表面或者内部带菌而引起的污染；外因污染则是主要由环境污染和操作不当引起，是指在接种或培养过程中病菌入侵，例如培养基、接种工具和接种室消毒不严格以及操作不规范等[8]。 针对植物组织培养中污染产生的原因，应从以下2个方而着手来控制污染。一是控制外植体自身带菌，外植体的表而带菌可以经过一系列的杀菌处理来减少；而外植体的内部带菌是不容易清除的，但也可以通过对外植体的预培养来加以控制；一是降低环境污染和操作污染，这类污染可通过规范操作程序加以控制[9]。 2.2 褐化问题 2.2.1. 发生形式 细胞受胁迫条件或其他不利条件影响而死亡或细胞发生自然死亡；材料伤口分泌的酚类物质，在多酚氧化酶作用下氧化为醌类物质形成的。 2.2.2 影响因素 外植体、培养基、pH值、培养条件、其他。 2.2.3 解决途径 2.2.3.1 选取适宜的外植体 一般木本植物的酚类化合物较草本高，组培时木本植物更易褐化；外植体的老化程度越高，其木质素的含量也越高，也越易褐化，成龄材料一般比幼龄材料褐化严重[10]，切口越大，酚类物质的被氧化面积也越大，褐化程度就会越严重；由于植物体内酚类化合物含量和多酚氧化酶的活性在不同的生长季节不同，一般在生长季节含较多的酚类化合物，在取材部位上存在幼嫩茎尖较其他部位褐化程度严重。 2.2.3.2 选取适宜的培养基 (1)利用抗氧化剂、吸附剂。抗氧化剂能够阻止多酚氧化物对酚类物质的氧化作用，减少褐变。目前常用的抗氧化剂有硫代硫酸钠(Na2S2O3)、植酸(PA)、抗坏血酸(Vc)、过氧化氢、半胱氨酸等，吸收剂有活性炭(AC)和PVP(聚已烯吡喀烷酮)[11]。抗氧化剂要注意分次使用，应注意有些抗氧化剂会对培养物产生毒害作用，要避免长期在含这些抗氧化剂的培养基中培养，如果先期褐变得到了控制，就应该从培养基中除去抗氧化剂。杨薇红等在亚洲百合接种前用50 mg/L Vc浸泡外植体2 h及在之后的继代培养中加入150 mg/L PVP以抑制组培苗褐变现象的发生[12]。张红对库拉索芦荟组培中的褐变现象,培养基中加入活性炭500.0 mg/L，环境温度控制在25 ℃有利于减轻褐变[13]。 (2)使用金属螯合剂(EDTA)。由于多酚氧化酶是一种含铜的蛋白质，其氧化活性依赖于铜的氧化还原作用，而金属螯合剂可以把铜离子从酶中螯合出来，形成稳定的螯合物，使多酚氧化酶失去活性。 (3)琼脂量的减少、较低的pH值利于减少褐变。 (4)培养基中适宜的细胞分裂素浓度可以减轻或抑制褐变。这在很多植物的组培研究中都得到证实，张红在库拉索芦荟组培中的褐变现象及防止试验中也表明，适宜的6-BA浓度(2.0 mg/L)对库拉索芦荟的褐变现象有较好的抑制作用[14]。 2.2.3.3 选取适宜的培养条件 试验证明适度的低温、初培暗光或弱光培养可抑制酚类的氧化。陈红等在试验中，低温预处理对刺梨花药愈伤组织诱导有显著的影响，以低温处理3 d，花药愈伤组织诱导率最高，褐化率最低[15]。赵伶俐等以蝴蝶兰R4品种叶片为外植体，研究不同时间的黑暗预处理对褐化率、多酚氧化酶(PPO)活性和总酚含量的影响。结果表明，黑暗预处理能减轻褐化[16] 。 2.2.3.4 其他方法 热击处理，采用45 ℃以上的短时间高温处理能够使多酚氧化酶失去活性[17]，从而达到抗褐变的目的，另外适度缩短继代周期，可以从一定程度上使褐变减轻。 2.3 玻璃化现象 2.3.1 作用机理 内源激素失调，能量代谢受阻，蛋白质的正常合成受抑，使分化难以顺利启动，细胞发育异常而致。 2.3.2 发生因素 外植体材料差异、环境湿度、碳源、无机盐、外源激素、温度、光照、培养基pH值及其添加物等。 2.3.3 克服方法 2.3.3.1 适宜的外植体 刘非燕等在试验中发现，重瓣石竹顶芽产生的试管苗玻璃化百分率最低，基部茎段次之，中部茎段最高[18]。分析这种差异性主要是由顶芽到茎基在内源激素含量和比例上的差异而致。 2.3.3.2 培养基的硬度 调节培养基的pH值，提高琼脂浓度，玻璃化的比例明显下降。 2.3.3.3 培养基成分 提高培养基的碳氮比，降低NH+4 浓度或及时转移培养基，在其中加入适量的根本苷、活性炭或聚乙烯醇和青霉素G钾等添加物。 2.3.3.4 合适的培养环境 适当提高光照强度，保持适宜温度25 ℃(19.5～30 ℃)利于控制玻璃化[19]，降低湿度(瓶内的空气湿度和培养基的含水量)，改善氧气供应状况利于减少玻璃化苗的出现[18]。 2.3.3.5 适当降低细胞分裂素浓度和细胞分裂素与生长素比例 许多报道指出，培养基中外源细胞分裂素供应过多容易导致组培苗玻璃化。如在沾化冬枣的快繁中，培养基中6-BA 的浓度为3～5 mg/L 时，能显著促进外植体发生褐化；在重瓣丝石竹的组培中发现，培养基中高浓度的细胞分裂素，尤其在6-BA为5.0 mg/L时，是影响玻璃苗发生的主要原因[20]。 2.3.3.6 热击处理 高于40 ℃的温度对外植体热击处理可消除玻璃化。 2.4 黄化现象 2.4.1 原因 培养基中Fe的含量不足；各矿质营养不均衡；培养环境通气不良,瓶内乙烯含量升高；激素配比不当；糖用量不足或长时间不转移导致糖耗尽；pH值变化过大；培养温度不适；光照不足等都会造成黄化现象的出现[21]。 2.4.2 解决方法 (1)配制母液和培养基的制作过程中,要检查仪器设备是否准确,还要认真细致地核对每项称量的每一个环节。 (2)配制培养基时切记不要忘记加糖。 (3)及时转接培养物。 (4)使用透气的封口膜以改善瓶内通气状况。 (5)适当调节pH值、激素配比和无机盐浓度。 (6)控制培养室内的温度；适当增加光照。 (7)在培养基中添加抗生素类物质如青霉素、链霉素、头孢霉素等,有时也会出现幼苗黄化现象，应适当减少用量或停止使用。 3 植物组织培养的应用 植物组织培养技术不仅是植物体细胞遗传学的基础，而且对理论研究和植物基因工程以及农作物品种改良等都具有重大意义。 3.1在植物育种上的应用 3.1.1进行单倍体育种 取未成熟的花药或花粉粒培养，很容易获得单倍的胚状体，然后用秋水仙碱等加倍剂处理胚状体，使染色体加倍，形成正常的二倍体。与一般二倍体不同的是，这样获得的二倍体基因型是纯合的。在自然界，自花授粉植物是纯系，而异花授粉植物基因型是杂合的。要获得异花授粉植物的纯系，至少需要自交10代以上。对于自粉授粉植物，通过杂交方式导入新的基因后，利用花药或花粉单倍体培养，然后加倍，获得纯系，将大大缩短育种年限[22]。同样，对于异花授粉植物，利用花药和花粉培养可缩短杂交后代的纯合时间，加快杂交育种进度[23]。然而，花药和花粉单倍体培养主要在自花授粉植物中获得成功，对于异花授粉植物还比较困难。花药和花粉单倍体培养的技术完善和突破，将会推动杂交育种的发展。 3.1.2克服远缘杂交不亲和性 carlsno等在1972年获得第一株烟草体细胞杂种植株以来，细胞融合技术在不断改善和发展，获得体细胞杂种植株的植物种类在不断增加[24]。细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲和性障碍，在植物新品种的培育和种性的改良中有着巨大的潜力。通过原生质体融合，不仅可克服远缘杂交的不亲和性，而且能创造新品种和从中选择到优良品种；还可转移植物杂交育种上有重要价值的细胞质雄性不育基因，迅速选育出期望的雄性不育系[25]。在经济林木和果树上，柑桔原生质体融合是最早而且是成功事例最多的种类。 3.1.3获得抗病品种 无论是愈伤组织培养还是细胞培养，培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件和外界因素(如射线、化学物质等)的影响而产生诱变[26]。从中可以筛选出对人们有用的突变体，从而育成新品种。例如植物抗病虫性、抗寒、耐盐、抗除草剂毒性、生理生化变异株等的诱发，为进一步筛选和选育提供了丰富的变异材料[27]。1988年美国ostyr等[28]利用细胞变异成功筛选出杨树抗病新无性系。目前，用这种方法已筛选到抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白、矮秆高产的突变体，有些已用于生产。 3.2 快繁和植株再生体系的建立 植物组织培养快繁技术具有周期短，繁殖快，节省空间的优点。用无性系快速繁殖比种子繁殖节省时间。据不完全统计，目前己有92个属、近300种树种通过器官或组织培养技术获得了完整的试管植株，如杨属、蔷薇科、芸香科及豆科多个属中的许多种，还有银杏、枣、茶、荔枝、杜鹃等，其中按树、杨树、辐射松等重要树种已大面积应用于生产，澳大利亚、新西兰己分别实现用按树和辐射松试管苗造林[29]。大量研究表明，从愈伤组织表面或内部形成芽和根，其分化取决于培养基中细胞分裂素和生长素的比例，高浓度的细胞分裂素有利于芽的分化，而高水平的生长素则诱导根的形成。胚状体发生是木本植物植株再生的另一条重要途径。据不完全统计，目前高等植物已有50科约180多种植物可通过胚状体发生途径再生植株[30]。 4 植物组织培养的前景和展望 组织培养技术已为人们广泛的应用在各个领域，它为许多学科研究植物生长发育、抗性生理、激素及器官发生与胚胎发生等提供了许多良好试材和有效途径。 但组培育苗存在成本高、技术复杂等问题，随着科学技术的不断发展，组培育苗将在未来植物繁殖中占有重要地位。其发展趋势如下[31]: ( 1 ) 组培技术育苗植物种类不断增加。如组培技术育苗种类有果树、蔬菜、草坪草、花卉、香料植物、药用植物、茶叶、农作物等，既有草本又有木本。 ( 2 ) 组培技术程序简化，组培成本降低。例如: 用全自然光代替人工光照的组培育苗技术，使组培育苗的成本大幅度降低；新药品、新方法的运用将使传统的组培技术得以改进，使组培育苗技术更经济、更实用。 ( 3 ) 组培技术不断提高。由最初的茎尖快繁到花药培养、胚胎培养、原生质体培养、体细胞杂交等。 ( 4 ) 组培技术的应用范围不断扩大。由植物的简单繁育到突变体选育、种植资源保存等。 ( 5 ) 组培技术逐渐向自动化方向发展。随着现代化温室在我国的应用及环境控制水平的提高, 组培育苗将与现代化温室、电脑自控调节等手段相结合, 使其效率更高。 参考文献: [1] 王鲁彤. 浅谈植物组织培养技术存在的问题与应用[J]. 现代农业科学, 2009，(8): 102–104 [2] 王文静，袁道强，高松洁. 植物组织培养的应用现状[J]. 河南师范大学学报, 2000，(3): 137–139 [3] 盛玉婷. 植物组织培养技术及应用进展[J]. 安徽农学通报，2008，(9)：14-15 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2022-07-11
